长期暴露于慢性压力会在与疼痛处理相关的神经通路上产生适应不良的神经生物学变化，这可能会导致应激诱导的痛觉过敏（SIH）。然而，其潜在机制在很大程度上仍不为人知。在先前的研究中，我们曾报道过杏仁核参与了慢性强迫游泳（FS）应激诱导的大鼠抑郁样行为以及神经病理性疼痛的加剧，其中，基底外侧杏仁核（BLA）和杏仁核中央核（CeA）在整合包括伤害感受在内的情感和感觉信息方面发挥着重要作用。在此，通过对喙部前扣带回皮质（rACC）和基底外侧杏仁核（BLA）进行体内多通道记录，我们发现慢性强迫游泳应激（CFSS）能够增加大鼠对施加在后爪上的低强度无害刺激（LIS）和高强度伤害性刺激（HNS）的疼痛敏感性，从而证实了应激大鼠中存在应激诱导的痛觉过敏现象。此外，我们还发现，慢性强迫游泳应激（CFSS）不仅会导致喙部前扣带回皮质（rACC）神经元群体的活动增加，还会使其局部场电位（LFP）的场电位功率（FPP）增强，尤其是在基线状态以及低强度无害刺激（LIS）和高强度伤害性刺激（HNS）条件下的低频 θ 频段和高频低 γ 频段范围内。另外，通过使用互相关方法和部分定向相干（PDC）算法来分析喙部前扣带回皮质（rACC）和基底外侧杏仁核（BLA）的局部场电位（LFP）振荡活动，我们证明了慢性强迫游泳应激（CFSS）能够显著促进喙部前扣带回皮质（rACC）和基底外侧杏仁核（BLA）区域之间的同步性，并且还增强了从喙部前扣带回皮质（rACC）到基底外侧杏仁核（BLA）的神经信息流。我们得出结论，大鼠长期暴露于慢性强迫游泳应激（CFSS）会导致喙部前扣带回皮质（rACC）神经元群体的活动增加，促进喙部前扣带回皮质（rACC）和基底外侧杏仁核（BLA）区域之间的功能连接性和同步性，同时增强从喙部前扣带回皮质（rACC）到基底外侧杏仁核（BLA）的与疼痛相关的神经信息流，这些很可能是应激诱导的痛觉过敏（SIH）发病机制的基础。
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一、引言
慢性压力引起的抑郁症会增加患者及其家人的痛苦，这是一个重要的健康问题。压力引起的痛觉过敏（SIH）以及疼痛与慢性压力相关抑郁症的共病，代表了现代社会中一系列重要的临床挑战。抑郁症患者常常经历更严重的疼痛。此外，焦虑和抑郁样行为也在患有神经病理性疼痛的大鼠中显著增加。许多慢性疼痛患者似乎也有明显的焦虑和抑郁症状。在临床实践中，慢性疼痛也与负面情绪反应和认知障碍有关。我们之前的研究表明杏仁核参与了慢性强迫游泳（FS）压力诱导的抑郁样行为以及大鼠神经病理性疼痛的加剧，其中，基底外侧杏仁核（BLA）和中央杏仁核（CeA）在整合情感和感觉信息（包括痛觉）方面发挥重要作用。
慢性压力会导致许多大脑区域的形态和功能变化。多个皮质和皮下区域被发现对慢性压力相关的负面情绪、抑郁和慢性疼痛的调节起着关键作用。前扣带皮质（ACC）是痛觉感知和疼痛相关焦虑的重要中枢，它可以分为认知区域（背侧ACC，dACC）和情感区域（前侧ACC，rACC）。rACC与杏仁核、导水管周围灰质（PAG）、下丘脑、海马和眶额叶皮质紧密相连，从而参与自主神经活动、内分泌活动、动机信息评估和情绪反应。功能上，杏仁核通过侧/基底外侧杏仁核（LA/BLA）从上皮质区域接收多感觉信息，并通过旁核（PB）直接投射痛觉信息。高度整合的压力-情感相关的信息随后被传递到CeA，杏仁核的主要功能输出核，以调节疼痛相关行为。BLA在调节神经病理性疼痛方面发挥重要作用，包括处理疼痛情感-动机成分的神经回路。此外，BLA与多种大脑功能和疾病密切相关，例如认知和情感功能，BLA神经元的过度兴奋涉及SIH的发病机制。ACC到BLA的直接神经投射在调节情感功能（如恐惧学习）中起关键作用。因此，慢性强迫游泳（FS）压力不仅会导致rACC神经元的过度激活，还会增加rACC和杏仁核之间的相互作用。理论上，rACC神经元活动的改变可能会影响BLA神经元的活动。
基于上述证据，我们假设慢性压力诱导的疼痛敏感性增加可能依赖于rACC-BLA通路的激活，即rACC神经元兴奋性的增加和从rACC到BLA的信息流增强。在这项研究中，通过在自由活动的大鼠中使用体内多通道记录技术，我们研究了慢性强迫游泳压力（CFSS）是否会加剧大鼠对后足施加的无害和有害刺激的疼痛敏感性。此外，我们还检查了rACC神经元活动的增加、rACC局部场电位（LFP）的功率谱活动以及从rACC到BLA的疼痛相关神经信息流增强是否是SIH发病机制的基础。
二、材料与方法
01. 动物
实验使用了体重为300-350克的雄性Sprague-Dawley大鼠，由北京大学医学部实验动物科学部提供。大鼠被单独饲养在笼子中，自由获取食物和水，并保持在温度（20-22°C）、湿度（50-55%）和光照（12:12小时光：暗周期）控制的环境中。所有程序均获得北京大学动物护理和使用委员会的批准。
02. 慢性强迫游泳压力（CFSS）程序
在这项研究中，选择慢性强迫游泳作为压力源，并按照之前描述的方法进行。简言之，将大鼠放入一个高45厘米、直径20厘米的玻璃缸中，缸内装有0±2°C的冰水，水深30厘米。强迫游泳程序每天对大鼠进行一次，每次15分钟，连续进行7天。根据其他地方描述的方法，对照组大鼠接受假游泳（假FS）处理，让它们在只装有2-4厘米温水（24-26°C）的缸中涉水。我们使用假FS动物而不是未处理动物作为对照组，以排除大鼠对水的适应因素。游泳后，大鼠在30-33°C的温暖环境中烘干。每次更换水并彻底清洁容器。电生理活动和行为测试分别在强迫游泳程序之前和之后记录。
03. 体内多通道记录
0301. 手术
在植入微电极阵列之前，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50毫克/千克）进行初始麻醉。在手术过程中，根据需要给予补充剂量（原始剂量的1/3）以维持适当的麻醉深度。将大鼠固定在立体定位仪上，将8根镍铬合金丝微线（直径14微米，以4×2配置排列，每根微线间距250微米）缓慢插入右侧rACC（0至2.0毫米至前囟，0至1.2毫米至中线，深度1.5毫米）和右侧BLA（1.6至3.4毫米至后囟，4.4至5.5毫米至中线，相对于硬膜的深度为6.8毫米），根据Paxinos和Watson的大鼠脑图谱进行操作。在植入微线后，用6个不锈钢螺钉将微线固定在头骨上。大鼠在手术前接受青霉素注射（16,000 IU，肌肉注射）以预防感染，手术后恢复一周，然后开始记录会话。
0302. 电生理记录
将大鼠放置在一个透明塑料箱（40×40×30厘米，带有2×8毫米的不锈钢网格板）中，箱内温度为22±1°C，允许大鼠在记录期间自由活动。在动物适应实验环境后记录电生理信号。使用多通道记录系统同时从rACC和BLA记录多单位神经元活动和宽带局部场电位（LFP）信号。通过植入的微线组件收集神经元尖峰信号，这些组件通过头部插头和轻质电缆连接到前置放大器，接地线用作参考。前置放大器的输出经过滤波（0.5和5千赫，6分贝截止）后，发送到多通道尖峰排序设备进行在线信号处理。在实验中，从400秒时间窗口中采样rACC和BLA神经元的自发电活动。使用NeuroExplorer软件分析尖峰列车活动。通过波形捕获和频率分布直方图验证单个单位的在线分类。通过设置多个时间-电压窗口，使用OfflineSorter软件区分不同的波形。这些波形的时间戳随后存储在个人计算机中，以便进行离线分析。在本研究中，分别记录了大鼠在低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）下，rACC和BLA神经元的自发电活动以及激光刺激诱发的活动。在压力暴露前后分别记录了这些诱发活动。在时间框架从激光刺激前2秒到激光刺激后2秒内采样并分析rACC和BLA神经元的诱发活动。每个记录会话包含10次LIS试验和10次HNS试验，随机进行，每次刺激间隔不少于120秒，以避免痛觉过敏。
同时，通过微线阵列记录来自右侧rACC和BLA的LFP信号，使用多通道数据采集系统。LFP信号通过头部组件传输到前置放大器。LFPs以10千赫的采样频率收集，放大300倍，并带通滤波（0.3-500赫兹）。LFP信号被过滤为五个频率带：theta（4-8赫兹）、alpha（9-12赫兹）、beta（13-30赫兹）、低gamma（31-70赫兹）和高gamma（71-100赫兹），其中theta、alpha和beta带属于低频率带（4-30赫兹），而低gamma和高gamma带属于高频率带（31-100赫兹）。这些五个频率带以及宽带（4-100赫兹）LFP信号随后通过Hilbert变换进行分析。
0303. 数据分析
使用NeuroExplorer软件对每个神经元的放电率进行量化，以构建从压力开始到5分钟后的不同组别的速率直方图。计算基线和LIS/HNS诱发放电直方图的箱大小分别为1秒和50毫秒。使用NeuroExplorer软件计算每个试验的箱计数，并将结果以电子表格形式导出到Matlab软件中。所有神经元的放电率被标准化并排列到电子表格中，以便进行进一步的统计分析。局部场电位（LFP）数据被重新采样为1千赫，并分别对每个400秒的记录周期进行基线LFP分析，或对每个4秒（从激光刺激前2秒到激光刺激后2秒）的记录周期进行LIS/HNS诱发放电分析。然后通过快速傅里叶变换（FFT）计算时变功率谱。通过功率谱分析计算场电位功率（FPP）。
04. 行为测试
在所有实验中，电生理信号和动物行为的视频记录同时进行。使用Cineplex Studio软件将视频与记录的动物行为同步。在实验中，分别记录了大鼠在低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）下的rACC和BLA神经元的自发电活动以及激光刺激诱发的活动。激光束（波长10.6毫米，直径2.5毫米，脉冲宽度10毫秒）通过塑料箱底部的多排孔照射到大鼠的左后足，由一台二氧化碳激光治疗机提供。通过立即的足部撤回反应识别疼痛行为。疼痛行为测试与每次电生理记录会话同时进行。
05. 组织学
实验结束后，大鼠用戊巴比妥钠深度麻醉，通过电极向附近区域组织传递2毫安、10秒的直流电流（阳极电流），以产生热损伤，从而确定电极的尖端位置。随后，动物被处死，并用0.9%生理盐水灌注，接着用4%甲醛固定。在4°C下用甲醛固定过夜后，将大脑转移到20%蔗糖溶液中进行冷冻保护。在微切片机上切取30微米厚的冠状切片，将切片安装在带电的载玻片上，并用中性红染色10-15分钟。在光学显微镜下确定记录位点（补充数据，图S1）。如果位点偏离目标区域，则将这些数据从分析中排除。
06. 统计分析
使用Matlab 2015a和GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析和图形绘制。所有数据以均值±标准误表示。使用双尾非配对t检验比较两组之间的均值。对于多重比较，使用双因素方差分析（ANOVA），随后进行Bonferroni或Tukey事后检验。P<0.05被认为是统计学上显著的。
三、结果
01. 慢性强迫游泳压力增加了大鼠对低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）的疼痛敏感性
为了探索慢性强迫游泳压力（CFSS）对大鼠疼痛行为的影响，我们分别检查了对后足施加的无害和有害激光刺激引起的疼痛敏感性。实验流程如图1A所示。行为结果显示，在CFSS处理的大鼠中，对低强度无害刺激（LIS）（32.5±4.8% CFSS后 vs. 5.0±5.0% CFSS前，F1,12=3.56，P=0.0065，图1B）和高强度有害刺激（HNS）（97.5±2.5% CFSS后 vs. 50.0±15.8% CFSS前，F1,14=0.31，P=0.0365，图1C）的足部撤回比率显著增加（双因素方差分析，每组4-5只大鼠）。此外，与假CFSS处理的大鼠相比，CFSS处理的大鼠对LIS的足部撤回比率显著增加（32.5±4.8% CFSS后 vs. 12.5±7.5% 假CFSS后，F1,12=3.56，P=0.0411，图1B）（双因素方差分析，每组4只大鼠）。然而，在假CFSS处理的大鼠中，无论是对LIS（12.5±7.5% 假CFSS后 vs. 5.0±2.9% 假CFSS前，F1,12=3.56，P=0.6741）还是对HNS（87.5±6.3% 假CFSS后 vs. 54.0±14.7% 假CFSS前，F1,14=0.31，P=0.1554）的足部撤回比率均无显著变化（双因素方差分析，每组4-5只大鼠）。这些结果表明，CFSS暴露使大鼠的疼痛敏感性增加，即观察到的压力诱导的痛觉过敏（SIH）。
图 1. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对大鼠后爪受到无害和有害激光刺激时疼痛敏感性的影响。(A)：实验过程示意图。(B、C)：CFSS 对大鼠对低强度无害刺激 (LIS) (B) 和高强度有害刺激 (HNS) (C) 时爪缩回率的影响。请注意，CFSS 可显著增加大鼠对 LIS 和 HNS 的爪缩回率。⁎P < 0.05 或 ⁎⁎P < 0.01，双向方差分析后进行 Bonferroni 事后检验，每组 n = 4-5 只大鼠。
02. 慢性强迫游泳应激增加大鼠rACC神经元的基线活动
长期暴露于负面事件，如慢性强迫游泳应激（CFSS），会改变皮层神经元的兴奋性。为了确定CFSS对rACC神经元基线活动的影响，我们首先使用体内多通道记录技术检测了暴露于CFSS或假CFSS的大鼠rACC神经元的自发放电活动。共记录了132个rACC神经元，包括6只接受CFSS处理的大鼠的73个神经元和4只接受假CFSS处理的大鼠的59个神经元。暴露于CFSS或假CFSS的大鼠rACC神经元的代表性基线放电活动如图2A至D所示。统计结果显示，CFSS暴露后大鼠rACC神经元的平均自发放电率（在400秒采样时间窗内）显著增加（放电频率：5.45 ± 0.36次/秒，CFSS后；3.52 ± 0.22次/秒，CFSS前；F1,247 = 17.51，P < 0.0001，双因素方差分析，图2C、D和E）。相比之下，假CFSS处理的大鼠rACC神经元的平均自发放电率未发生显著变化（放电频率：3.10 ± 0.16次/秒，假CFSS后；3.42 ± 0.25次/秒，假CFSS前；F1,247 = 17.51，P = 0.8542，双因素方差分析，图2A、B和E）。此外，CFSS处理的大鼠在应激暴露后的rACC神经元平均自发放电率显著高于假CFSS处理的大鼠（放电频率：5.45 ± 0.36次/秒，CFSS；3.10 ± 0.16次/秒，假CFSS；F1,247 = 17.51，P < 0.0001，双因素方差分析，图2E）。此外，应激暴露后，CFSS处理大鼠的rACC神经元放电率相对于基线（即应激前）的归一化值为154.6 ± 10.2%，而假CFSS处理大鼠为90.7 ± 4.7%（t117 = 5.21，P < 0.0001，双尾t检验，图2F）。这些数据表明，CFSS暴露可增强大鼠rACC神经元的基线活动，即诱导rACC神经元的致敏化。
图 2. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对大鼠 rACC 神经元基线活动的影响。(A–D)：暴露于假 CFSS (A、B) 或 CFSS (C、D) 的大鼠中 rACC 神经元的代表性基线放电活动。直方图显示 400 秒时间窗口采样期间 rACC 神经元的放电率（每秒脉冲数）。箱宽 = 1 秒。插图显示从 rACC 神经元记录的自发放电活动的原始轨迹。比例尺：150 μV，5 秒。(E)：不同组 rACC 神经元的平均自发放电率。请注意，暴露于 CFSS 的大鼠中 rACC 神经元的平均自发放电率显著增加。⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析后进行 Bonferroni 事后检验，每组 n = 52-73 个神经元。(F)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠中应激后 rACC 神经元的归一化放电率相对于应激前 rACC 神经元的平均基线活动。⁎⁎⁎P < 0.001，双尾非配对 t 检验，每组 n = 52-67 个神经元。
03. 慢性强迫游泳应激增加大鼠rACC神经元对低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）的活动
接下来，我们检测了应激暴露前后大鼠rACC神经元对LIS和HNS的诱发放电率。rACC神经元的诱发放电率在激光刺激前2秒至刺激后2秒的时间窗内采样并分析。暴露于CFSS或假CFSS的大鼠rACC神经元的代表性LIS和HNS诱发放电活动如图3A和D所示。统计结果显示，在CFSS处理的大鼠中，LIS和HNS均显著增加了应激暴露后rACC神经元的激光诱发放电率。例如，LIS诱发的rACC神经元放电率从CFSS前的4.26 ± 0.32次/秒增加到CFSS后的10.07 ± 0.46次/秒（F1,161 = 61.64，P < 0.0001，双因素方差分析，图3B），HNS诱发的放电率从CFSS前的8.58 ± 0.39次/秒增加到CFSS后的22.86 ± 0.51次/秒（F1,166 = 239.6，P < 0.0001，双因素方差分析，图3E）。然而，在假CFSS处理的大鼠中，LIS（5.00 ± 0.42次/秒，假CFSS前；4.51 ± 0.31次/秒，假CFSS后；F1,161 = 61.64，P = 0.8454，双因素方差分析，图3B）或HNS（7.21 ± 0.39次/秒，假CFSS前；7.78 ± 0.44次/秒，假CFSS后；F1,166 = 239.6，P = 0.7803，双因素方差分析，图3E）暴露后，rACC神经元的激光诱发放电率未发生显著变化。此外，应激暴露后，CFSS处理大鼠的LIS诱发放电率（10.07 ± 0.46次/秒）和HNS诱发放电率（22.86 ± 0.51次/秒）均显著高于假CFSS处理大鼠（LIS：4.51 ± 0.31次/秒；HNS：7.78 ± 0.44次/秒；双因素方差分析，图3B和E）。同样，应激暴露后，CFSS处理大鼠的rACC神经元放电率相对于应激前激光诱发活动的归一化值显著高于假CFSS处理大鼠，无论是LIS（236.6 ± 10.8%，CFSS；90.1 ± 6.3%，假CFSS；t77 = 10.41，P < 0.0001）还是HNS（266.5 ± 6.0%，CFSS；77.5 ± 6.5%，假CFSS；t80 = 21.21，P < 0.0001；双尾t检验，图3C和F）。这些结果表明，CFSS暴露不仅增强了大鼠rACC神经元对LIS和HNS的激光诱发活动，还进一步证实了慢性应激可诱导大鼠rACC神经元的致敏化。
图 3. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对大鼠无害和有害激光刺激引起的 rACC 神经元活动的影响。(A–C)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠中低强度无害刺激 (LIS) 引起的 rACC 神经元放电活动。(A)：暴露于 CFSS 或假 CFSS 的大鼠中代表性 LIS 引起的 rACC 神经元放电活动。直方图显示从激光刺激前 2 秒到激光刺激后 2 秒的时间窗口内 rACC 神经元的放电率（每秒脉冲数）。箱宽 = 50 毫秒。插图显示激光诱发的 rACC 神经元放电的原始轨迹（上）和脉冲分布的散点图（下）。比例尺：150 μV，0.5 秒。（B）：不同组中 LIS 诱发的 rACC 神经元活动的平均放电率。请注意，暴露于 CFSS 的大鼠中，rACC 神经元的平均激光诱发放电率显著增加。⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析后进行 Bonferroni 事后检验，每组 n = 32-50 个神经元。(C)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后 rACC 神经元的归一化放电率与应激前 rACC 神经元的平均激光诱发活动的关系。⁎⁎⁎P < 0.001，双尾非配对 t 检验，每组 n = 32-47 个神经元。(D–F)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠中高强度有害刺激 (HNS) 诱发的 rACC 神经元放电活动。(D)：暴露于 CFSS 或假 CFSS 的大鼠中代表性的 HNS 诱发的 rACC 神经元放电活动。直方图显示从激光刺激前 2 秒到激光刺激后 2 秒的时间窗口内 rACC 神经元的放电率（每秒尖峰数）。箱宽 = 50 毫秒。插图显示激光诱发的 rACC 神经元放电的原始轨迹（上）和尖峰分布的散点图（下）。比例尺：150 μV，0.5 秒。（E）：不同组中 HNS 诱发的 rACC 神经元活动的平均放电率。请注意，暴露于 CFSS 的大鼠中 rACC 神经元的平均激光诱发放电率显著增加。⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析后进行 Bonferroni 事后检验，每组 n = 36-48 个神经元。（F）：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠中应激后 rACC 神经元的标准化放电率与应激前 rACC 神经元的平均激光诱发活动相对应。⁎⁎⁎P < 0.001，双尾非配对 t 检验，每组 n = 36–46 个神经元。
04. 慢性强迫游泳应激增强大鼠rACC局部场电位的基线场电位功率
此外，我们还检测了慢性应激是否会影响大鼠rACC局部场电位（LFP）的基线场电位功率（FPP）。在本研究中，LFP信号被分为五个频率带：θ波（4–8 Hz）、α波（9–12 Hz）、β波（13–30 Hz）、低γ波（31–70 Hz）和高γ波（71–100 Hz），其中θ波、α波和β波属于低频带（4–30 Hz），低γ波和高γ波属于高频带（31–100 Hz）。在分析4–100 Hz宽带频率范围的LFP时，我们发现CFSS后rACC LFP的场电位功率显著增加，主要变化发生在低频范围LFP（图4）。图4A显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC FPP的原始LFP波形和平均时间频率分布；图4B和C显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP，我们发现CFSS后大鼠低频带（4–30 Hz）LFP的FPP显著高于其他三个对照组（CFSS前、假CFSS前和假CFSS后）。以应激前为基准，我们发现CFSS处理大鼠的应激后FPP在4–100 Hz宽带频率范围的LFP中也显著增加（图4D）。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在低频带（4–30 Hz）（0.014 ± 0.003，CFSS后；0.6 × 10^(-4) ± 0.3 × 10^(-5)，CFSS前；0.8 × 10^(-4) ± 0.2 × 10^(-4)，假CFSS后；P < 0.0001）和宽带（4–100 Hz）频率范围（0.005 ± 0.001，CFSS后；0.2 × 10^(-4) ± 0.1 × 10^(-5)，CFSS前；0.3 × 10^(-4) ± 0.47 × 10^(-5)，假CFSS后；P = 0.0172，与CFSS前相比；P = 0.0399，与假CFSS后相比）均显著增加（F6,48 = 7.205，双因素方差分析，图4E）。
同样，在分析rACC LFP的低频带（4–30 Hz）FPP时，我们也发现CFSS后rACC FPP显著增加（图4F至J）。图4F显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后低频带（4–30 Hz）LFP的平均时间频率分布；图4G和H显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图4I显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在θ波（0.044 ± 0.011，CFSS后；0.2 × 10^(-3) ± 0.1 × 10^(-4)，CFSS前；0.3 × 10^(-3) ± 0.5 × 10^(-4)，假CFSS后；P < 0.0001）和α波（0.018 ± 0.004，CFSS后；0.1 × 10^(-3) ± 0.4 × 10^(-5)，CFSS前；0.1 × 10^(-3) ± 0.2 × 10^(-4)，假CFSS后；P = 0.0107，与CFSS前相比；P = 0.0272，与假CFSS后相比）频率带显著增加，但在β波频率带（0.006 ± 0.002，CFSS后；0.25 × 10^(-4) ± 0.21 × 10^(-5)，CFSS前；0.29 × 10^(-4) ± 0.1 × 10^(-4)，假CFSS后；P = 0.6386，与CFSS前相比；P = 0.7152，与假CFSS后相比）未见显著变化（F6,48 = 5.906，双因素方差分析，图4J）。
此外，在分析rACC LFP的高频带（31–100 Hz）FPP时，我们发现CFSS处理大鼠在应激后的rACC FPP也显著增加（图4K至O）。图4K显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后高频带（31–100 Hz）LFP的平均时间频率分布；图4L和M显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图4N显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在低γ波（0.001 ± 0.3 × 10^(-3)，CFSS后；0.9 × 10^(-5) ± 0.1 × 10^(-5)，CFSS前；0.9 × 10^(-5) ± 0.95 × 10^(-6)，假CFSS后；P < 0.0001）频率带显著增加，但在高γ波频率带（0.4 × 10^(-3) ± 0.1 × 10^(-3)，CFSS后；0.4 × 10^(-5) ± 0.46 × 10^(-6)，CFSS前；0.5 × 10^(-5) ± 0.43 × 10^(-6)，假CFSS后；P = 0.0947，与CFSS前相比；P = 0.1587，与假CFSS后相比）未见显著变化（F3,32 = 7.056，双因素方差分析，图4O）。
这些数据表明，CFSS暴露可增加大鼠rACC LFP的基线FPP，尤其是在低频θ波和α波以及高频低γ波频率范围内。
图4. 慢性强迫游泳应激（CFSS）对大鼠rACC局部场电位（LFP）基线场电位功率（FPP）活动的影响。（A–E）：对rACC LFP的宽带（4–100 Hz）频率范围FPP的分析。（A）：CFSS处理和假CFSS处理大鼠应激前后rACC FPP的原始LFP波形和平均时间频率分布的代表性示例。标尺：200 μV，0.3秒。暖色和冷色分别表示rACC LFP FPP活动的增加和减少。（B和C）：显示CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP。（D）：CFSS和假CFSS处理大鼠应激后相对于应激前的归一化FPP。（E）：rACC LFP在低频（4–30 Hz）、高频（31–100 Hz）和宽带（4–100 Hz）频率范围内的FPP直方图。⁰P < 0.05，⁰⁰⁰P < 0.001，双因素方差分析后接图基多重比较检验，每组n = 4–6只大鼠。（F–J）：对rACC LFP的低频带（4–30 Hz）FPP的分析。（F）：CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后低频带LFP的rACC FPP的平均时间频率分布。暖色和冷色分别表示rACC LFP FPP活动的增加和减少。（G和H）：显示CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP。（I）：CFSS和假CFSS处理大鼠应激后相对于应激前的归一化FPP。（J）：rACC LFP在θ波（4–8 Hz）、α波（9–12 Hz）和β波（13–30 Hz）频率范围内的FPP直方图。⁰P < 0.05，⁰⁰⁰P < 0.001，双因素方差分析后接图基多重比较检验，每组n = 4–6只大鼠。（K–O）：对rACC LFP的高频带（31–100 Hz）FPP的分析。（K）：CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后高频带LFP的rACC FPP的平均时间频率分布。暖色和冷色分别表示rACC LFP FPP活动的增加和减少。（L和M）：显示CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP。（N）：CFSS和假CFSS处理大鼠应激后相对于应激前的归一化FPP。（O）：rACC LFP在低γ波（31–70 Hz）和高γ波（71–100 Hz）频率范围内的FPP直方图。⁰⁰⁰P < 0.001，双因素方差分析后接图基多重比较检验，每组n = 4–6只大鼠。
05. 慢性强迫游泳应激增强大鼠rACC局部场电位对低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）的场电位功率
除了rACC LFP的基线FPP外，我们还发现CFSS暴露可增强大鼠rACC LFP对LIS和HNS的FPP。图5显示了CFSS和假CFSS处理大鼠的LIS诱导的rACC LFP FPP。图5A显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC FPP的原始LFP波形和平均时间频率分布；图5B和C显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP，我们发现CFSS后大鼠低频带（4–30 Hz）LFP的FPP显著高于其他三个对照组（CFSS前、假CFSS前和假CFSS后）。同样，与假CFSS处理大鼠相比，CFSS处理大鼠应激后相对于应激前的归一化FPP主要在低频范围LFP中增加（图5D）。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在低频范围（0.6 × 10^(-3) ± 0.3 × 10^(-3)，CFSS后；0.1 × 10^(-3) ± 0.4 × 10^(-4)，CFSS前；0.1 × 10^(-3) ± 0.4 × 10^(-4)，假CFSS后；F6,36 = 0.738，P = 0.0153，与CFSS前相比；P = 0.0318，与假CFSS后相比）显著增加（双因素方差分析，图5E）。
进一步分析rACC LFP的低频带（4–30 Hz）FPP时，我们也发现CFSS后rACC FPP显著增加（图5F至I）。图5F和G显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图5H显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在θ波频率带（0.002 ± 0.9 × 10^(-3)，CFSS后；0.5 × 10^(-3) ± 0.2 × 10^(-3)，CFSS前；0.6 × 10^(-3) ± 0.2 × 10^(-3)，假CFSS后；F6,36 = 0.6379，P = 0.0296，与CFSS前相比；P = 0.0492，与假CFSS后相比）显著增加（双因素方差分析，图5I）。
然而，在分析rACC LFP的高频带（31–100 Hz）FPP时，CFSS和假CFSS处理大鼠之间未见显著差异（图5J至M）。图5J和K显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图5L显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP在低γ波（P = 0.7676，与CFSS前相比；P = 0.1122，与假CFSS后相比）和高γ波频率带（P = 0.9955，与CFSS前相比；P = 0.9746，与假CFSS后相比）均未见显著变化（F3,24 = 1.049，双因素方差分析，图5M）。
图 5. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对大鼠低强度无害刺激 (LIS) 诱发的 rACC 局部场电位 (LFP) 的场电位功率 (FPP) 活动的影响。(A–E)：宽带 (4–100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 分析。(A)：应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的原始 LFP 波形和 rACC FPP 的总平均时间频率分布的代表性示例。比例尺：120 μV，0.3 s。暖色和冷色分别表示 rACC LFP 的 FPP 活动的增加和减少。(B 和 C)：显示应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC LFP 的代表性 FPP 和平均 FPP。(D)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。(E)：低频 (4-30 Hz)、高频 (31-100 Hz) 和宽带 (4-100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACCFPP 直方图。⁎P < 0.05，双向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。(F-I)：rACC LFP 低频带 (4-30 Hz) FPP 分析。(F 和 G)：显示应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC LFP 代表性 FPP 和平均 FPP。(H)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。(I)：θ (4-8 Hz)、α (9-12 Hz) 和β (13-30 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 直方图。⁎P < 0.05，双向方差分析，然后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。(J-M)：rACC LFP 的高频带 (31-100 Hz) FPP 分析。(J 和 K)：显示 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠在应激前后的 rACC LFP 代表性 FPP 和平均 FPP。(L)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。(M)：低伽马 (31-70 Hz) 和高伽马 (71-100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 直方图。P > 0.05，CFSS 治疗后与 CFSS 治疗前或 CFSS 治疗后与假性 CFSS 治疗后之间的比较，双向方差分析，然后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。
对于HNS诱导的rACC LFP FPP，图6A显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC FPP的原始LFP波形和平均时间频率分布；图6B和C显示了CFSS和假CFSS处理大鼠应激前后rACC LFP的代表性FPP和平均FPP，我们同样观察到CFSS后大鼠低频（4–30 Hz）LFP的FPP显著增加，与另外三个对照组（CFSS前、假CFSS前和假CFSS后）相比。然而，与假CFSS处理大鼠相比，CFSS处理大鼠应激后相对于应激前的归一化FPP在4–100 Hz宽带频率范围的LFP中增加（图6D）。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在低频带（4–30 Hz）（0.006 ± 0.001，CFSS后；0.1 × 10^(-3) ± 0.6 × 10^(-4)，CFSS前；0.2 × 10^(-3) ± 0.1 × 10^(-3)，假CFSS后；P < 0.0001）和宽带（4–100 Hz）（0.002 ± 0.4 × 10^(-3)，CFSS后；0.1 × 10^(-3) ± 0.9 × 10^(-4)，CFSS前；0.1 × 10^(-3) ± 0.1 × 10^(-3)，假CFSS后；P = 0.0105，与CFSS前相比；P = 0.0116，与假CFSS后相比）频率范围显著增加（F6,36 = 8.427，双因素方差分析，图6E）。
进一步分析rACC LFP的低频带（4–30 Hz）FPP时，我们也发现CFSS后rACC FPP显著增加（图6F至I）。图6F和G显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图6H显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在θ波频率带（0.03 ± 0.01，CFSS后；0.6 × 10^(-3) ± 0.3 × 10^(-3)，CFSS前；0.001 ± 0.5 × 10^(-3)，假CFSS后；F6,36 = 8.498，P < 0.0001）显著增加（双因素方差分析，图6I）。
此外，在分析rACC LFP的高频带（31–100 Hz）FPP时，我们发现CFSS处理大鼠在应激后的rACC FPP增加（图6J至M）。图6J和K显示了四组的代表性FPP和平均FPP；图6L显示了CFSS和假CFSS组应激后相对于应激前的归一化FPP。FPP直方图显示，与CFSS前或假CFSS后相比，CFSS后大鼠rACC LFP的FPP（单位：μV²/Hz）在低γ波频率带（0.001 ± 0.4 × 10^(-3)，CFSS后；0.2 × 10^(-3) ± 0.2 × 10^(-3)，CFSS前；0.2 × 10^(-3) ± 0.2 × 10^(-3)，假CFSS后；P = 0.0026，与CFSS前相比；P = 0.0027，与假CFSS后相比）显著增加，但在高γ波频率带未见显著变化（P = 0.5345，与CFSS前相比；P = 0.5360，与假CFSS后相比）（F3,24 = 2.046，双因素方差分析，图6M）。
综上所述，这些结果表明，CFSS暴露可增加大鼠rACC LFP对LIS和HNS的FPP，尤其是在低频θ波以及高频低γ波频率范围内。
图 6. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对高强度有害刺激 (HNS) 诱发的大鼠 rACC 局部场电位 (LFP) 场电位功率 (FPP) 活动的影响。 (A–E)：宽带 (4–100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 分析。 (A)：应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的原始 LFP 波形和 rACC FPP 的总平均时频分布的代表性示例。比例尺：120 μV，0.3 秒。暖色和冷色分别表示 rACC LFP 的 FPP 活动的增加和减少。 (B 和 C)：显示应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC LFP 的代表性 FPP 和平均 FPP。 (D)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。 (E)：低频 (4-30 Hz)、高频 (31-100 Hz) 和宽带 (4-100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 直方图。⁎P < 0.05，⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析随后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。 (F-I)：rACC LFP 的低频带 (4-30 Hz) FPP 分析。 (F 和 G)：显示应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC LFP 代表性 FPP 和平均 FPP。 (H)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。 (I)：rACC FPP 在 theta (4–8 Hz)、alpha (9–12 Hz) 和 beta (13–30 Hz) 频率范围 LFP 中的直方图。⁎⁎⁎P < 0.001，二向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。 (J–M)：rACC LFP 高频带 (31–100 Hz) FPP 分析。 (J 和 K)：显示应激前后 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC LFP 代表性 FPP 和平均 FPP。 (L)：CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠应激后相对于应激前的标准化 FPP。 (M)：低伽马 (31-70 Hz) 和高伽马 (71-100 Hz) 频率范围 LFP 中的 rACC FPP 直方图。⁎⁎P < 0.01，双向方差分析后接 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4 只大鼠。
06. 慢性强迫游泳应激促进rACC与BLA之间的同步性，并增加从rACC到BLA的神经信息流
为了进一步研究rACC与BLA区域之间的空间和时间相关性以及功能连接性，科学家们采用了一种方法，通过计算rACC和BLA区域的带通滤波LFP的瞬时幅度的交叉相关性来计算相干值，这些LFP是由LIS和HNS诱发的。相干值可以是正值（即两个区域的活动趋于同步上升或下降），也可以是负值（即一个区域的活动与另一个区域的活动呈反向相关，反之亦然），并且绝对值越大，相关性越高。此外，相干峰值处的负滞后表明一个脑区领先于另一个脑区，反之亦然，而接近零的滞后则意味着两个脑区的活动是同步的。此外，为了进一步探索在疼痛信息编码过程中脑区之间的神经信息流动方向性，科学家们引入了部分定向相干（PDC）算法。PDC值（向量长度）越接近1，一个脑区对另一个脑区的影响越大，反之亦然。当PDC值接近0时，两个脑区之间的相互影响是对称的。
图7A至F展示了CFSS或假CFSS处理大鼠的LIS诱导的rACC和BLA区域之间的相干性和PDC分析。图7A显示了一个代表性LIS诱发的rACC和BLA LFP的示例，表明CFSS暴露后两个脑区之间的高度同步性。rACC-BLA交叉相关峰值接近零的滞后为这种同步性提供了有力的验证。此外，为了深入研究rACC和BLA区域之间的协同活动特征，科学家们还分析了CFSS暴露后大鼠rACC和BLA区域低频（4–30 Hz）和低频（低-低）、高频（31–100 Hz）和高频（高-高），以及低频和高频（低-高）之间的LFP幅度的交叉相关性。结果表明，与对照组相比，CFSS处理大鼠在应激后低-低（0.87 ± 0.03，CFSS后；0.45 ± 0.04，CFSS前；0.53 ± 0.01，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）、高-高（0.94 ± 0.02，CFSS后；0.47 ± 0.04，CFSS前；0.41 ± 0.05，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）以及低-高（0.95 ± 0.02，CFSS后；0.36 ± 0.06，CFSS前；0.50 ± 0.02，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）频率带之间的相干系数显著增加（F6,59 = 2.847，双因素方差分析，图7C）。同样，θ波与θ波（0.93 ± 0.03，CFSS后；0.47 ± 0.04，CFSS前；0.43 ± 0.06，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）、低γ波与低γ波（0.93 ± 0.02，CFSS后；0.45 ± 0.05，CFSS前；0.50 ± 0.02，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）以及θ波与低γ波（0.91 ± 0.04，CFSS后；0.53 ± 0.05，CFSS前；0.55 ± 0.03，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）频率带之间的相干系数也显著增加（F6,60 = 1.271，双因素方差分析，图7D）。然而，在CFSS和假CFSS处理大鼠之间，无论是绝对PDC值（P > 0.9999，F12,80 = 0.264，双因素方差分析，图7E），还是应激后LFP相对于应激前LFP的归一化PDC值（P = 0.9997，F4,30 = 0.317，双因素方差分析，图7F）在rACC-BLA通路中均未见显著差异。
同样，图7G至L描述了CFSS或假CFSS处理大鼠的HNS诱导的rACC和BLA区域之间的相干性和PDC分析。图7G显示了一个代表性HNS诱发的rACC和BLA LFP的示例，表明CFSS暴露后两个脑区之间的高度同步性。rACC-BLA相关峰值接近零的滞后也为这种同步性提供了有力的验证。HNS诱导的LFP幅度在低-低（0.94 ± 0.03，CFSS后；0.42 ± 0.03，CFSS前；0.53 ± 0.02，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）、高-高（0.99 ± 0.03，CFSS后；0.42 ± 0.06，CFSS前；0.50 ± 0.04，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）以及低-高（0.98 ± 0.01，CFSS后；0.40 ± 0.08，CFSS前；0.54 ± 0.03，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）频率带之间的相干系数也显著增加（F6,60 = 0.280，双因素方差分析，图7I）。相应地，θ波与θ波（0.99 ± 0.01，CFSS后；0.36 ± 0.06，CFSS前；0.49 ± 0.06，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）、低γ波与低γ波（0.96 ± 0.02，CFSS后；0.32 ± 0.07，CFSS前；0.51 ± 0.03，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）以及θ波与低γ波（0.99 ± 0.01，CFSS后；0.47 ± 0.03，CFSS前；0.55 ± 0.03，假CFSS后；P < 0.0001，与CFSS前或假CFSS后相比）频率带之间的相干系数也显著增加（F6,60 = 0.862，双因素方差分析，图7J）。尽管在绝对PDC值方面未见显著差异（P > 0.9999，F12,80 = 0.374，双因素方差分析，图7K），但在θ波频率带中，CFSS暴露大鼠的应激后LFP相对于应激前LFP的归一化PDC值显著增加（117.6 ± 8.1%，CFSS；84.4 ± 18.5%，假CFSS；F4,37 = 2.403，P = 0.0437）（双因素方差分析，图7L）。
综上所述，上述数据表明，慢性强迫游泳应激不仅促进了rACC与BLA区域之间的功能连接性和同步性，还增强了疼痛相关神经信息从rACC到BLA的流动。
图 7. 慢性强迫游泳应激 (CFSS) 对 rACC 和 BLA 区域之间的功能连接和神经信息流方向性的影响。显示了 rACC 和 BLA 区域之间 LIS 诱导的 LFP (A–F) 和 HNS 诱导的 LFP (G–L) 的一致性和 PDC 分析。(A 和 G)：分别显示 rACC 和 BLA 中 LIS 诱发的 LFP (A) 和 HNS 诱发的 LFP (G) 的代表性轨迹的示例，以表明暴露于 CFSS 后大鼠的两个大脑区域之间的高度同步。比例尺：50 μV，0.2 秒。(B 和 H)：代表性轨迹显示了 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠中分别由 LIS (B) 和 HNS (H) 诱导的 rACC-BLA LFP 一致性的滞后。请注意，rACC–BLA 互相关峰值的接近零滞后为暴露于 CFSS 后两个大脑区域之间的这种同步提供了实质性的验证。（C 和 I）：大鼠暴露于 CFSS 后，rACC 和 BLA 区域中低（4-30 Hz）和低（低-低）、高（31-100 Hz）和高（高-高）以及低和高（低-高）频带之间的 LIS 诱发的 LFP 振幅 (C) 和 HNS 诱发的 LFP 振幅 (I) 的互相关分析。⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4-6 只大鼠。(D 和 J)：大鼠暴露于 CFSS 后，对 rACC 和 BLA 区域中的 theta 和 theta、低 gamma 和低 gamma 以及 theta 和低 gamma 频带之间的 LIS 诱发 LFP 振幅 (C) 和 HNS 诱发 LFP 振幅 (I) 进行互相关分析。⁎⁎⁎P < 0.001，双向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4-6 只大鼠。(E 和 K)：对 CFSS 和假 CFSS 治疗大鼠的 rACC 和 BLA 区域之间的 LIS 诱发 LFP (E) 和 HNS 诱发 LFP (K) 进行部分定向相干性 (PDC) 分析。P > 0.05，双向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4-6 只大鼠。(F 和 L)：在 CFSS 和假 CFSS 治疗的大鼠中，由 LIS (F) 和 HNS (L) 引起的应激后 LFP 相对于应激前 LFP 的标准化 PDC 值。⁎P < 0.05，双向方差分析后进行 Tukey 多重比较检验，每组 n = 4-6 只大鼠。
四、讨论
在本研究中，科学家们提供了多条证据，表明慢性强迫游泳应激（CFSS）可导致大鼠rACC神经元群体活动性增加，促进rACC与BLA区域之间的功能连接性和同步性，并增强疼痛相关神经信息从rACC到BLA的流动，这些变化可能构成了应激诱导性痛觉过敏（SIH）的发病机制基础。首先，研究发现CFSS确实增加了大鼠对低强度无害刺激（LIS）和高强度有害刺激（HNS）的疼痛敏感性，为SIH提供了直接的验证。其次，CFSS不仅诱导了rACC神经元群体活动性增加，还显著增强了rACC局部场电位（LFP）的场电位功率（FPP），尤其是在低频θ波段和高频低γ波段，无论是在基线状态下还是在LIS和HNS条件下。第三，通过使用交叉相关方法和部分定向相干（PDC）算法分析rACC和BLA LFP的振荡活动，科学家们发现CFSS显著促进了rACC与BLA区域之间的同步性，并增强了从rACC到BLA的神经信息流动。
长期或反复暴露于应激可导致与疼痛处理相关的神经生物学通路发生适应不良的变化，从而引发应激诱导性痛觉过敏（SIH）。应激既可以抑制疼痛（应激诱导性镇痛），也可以加剧疼痛（SIH），具体取决于应激源的性质、持续时间和强度。SIH的发病机制与慢性疼痛和精神障碍（如焦虑和抑郁）的共病性有共同的机制。在本研究中，科学家们发现CFSS暴露确实增加了大鼠对LIS和HNS的疼痛敏感性，这可能为SIH提供了直接的验证，这种现象在人类中也较为常见。
前扣带回皮层（ACC）在慢性疼痛的起始、发展和维持中起着关键作用。它还在疼痛信息的感知和相关情绪处理中发挥重要作用，因此被认为是整合疼痛情绪成分的重要脑区。相应地，光遗传学刺激ACC足以在正常动物中诱导疼痛和疼痛相关的焦虑及抑郁样行为，支持了ACC可能介导焦虑、抑郁和慢性疼痛之间相互作用的观点。据报道，rACC区域可能通过投射到参与疼痛感知的下游脑区，调节内脏、运动和内分泌相关的情绪行为表现。rACC神经元的自发放电活动与内脏疼痛反应增加相关，并与疼痛的情绪方面有关。多项临床和前临床数据表明，在应激相关障碍或应激状态下，rACC神经元的异常激活可能会增加痛觉，并增强疼痛体验的情绪方面。与这些发现一致，科学家们发现CFSS暴露不仅诱导了大鼠rACC神经元在基线状态下的自发放电活动增加，还增强了对LIS和HNS的反应性，表明慢性应激可能诱导大鼠rACC神经元的致敏化。
脑电图中低频（δ波、θ波和α波）和高频（β波和γ波）范围的节律性振荡与广泛的感知、感觉运动和认知操作相关。例如，δ波振荡与受损的神经功能相关，α波振荡主要作为自上而下的抑制机制，而θ波振荡可能促进神经可塑性，并参与触觉和疼痛信息处理过程。θ波振荡还在海马功能中发挥关键的网络级作用，抑制θ波振荡可能会损害学习和记忆。在炎症大鼠中，rACC LFP的δ波、θ波和α波频率带的FPP活动增加。这些发现支持了低频振荡在疼痛处理和SIH产生中的作用。另一方面，高频β波振荡可能涉及当前感觉运动或认知状态的维持，而β波振荡的异常增强可能导致当前状态的异常持续，以及灵活行为和认知控制的恶化。γ波振荡可能在选择和整合感觉相关的信息以形成连贯的感知中发挥重要作用，并参与疼痛感知和异常疼痛记忆。在健康人群中，有害激光刺激后γ波振荡的FPP增加，而在患有持续性肌肉疼痛或热痛的受试者中，前额中央区域的γ波振荡也增加。此外，γ波频率范围可以进一步分为低（或慢）γ波（31–70 Hz）和高（或快）γ波（71–100 Hz），以指示具有不同功能的大脑活动的不同网络状态。低频和高频γ波之间的区别对于评估全身麻醉对大脑电活动的影响很重要，高频γ波振荡的衰减和区域间去同步化似乎与意识丧失相关。
在本研究中，科学家们发现CFSS处理的大鼠在低频θ波和α波段以及高频低γ波段的rACC LFP基线FPP显著增加。同样，CFSS处理大鼠的LIS和HNS诱导的rACC FPP活动在θ波和低γ波频率带也显著增加。这些发现为理解rACC神经元活动的同步化（表现为rACC FPP在θ波和低γ波频率带的增强）在SIH处理中的重要作用提供了有力证据。
此前，科学家们曾报道杏仁核参与了CFSS诱导的抑郁样行为和大鼠神经病理性疼痛的加剧，其中BLA和CeA在整合情感和感觉信息（包括痛觉）中发挥重要作用。ACC到BLA的直接神经投射也参与了恐惧学习等情感功能。rACC与杏仁核之间的关联在多种神经和精神障碍（包括神经病理性疼痛）中增加，而ACC-BLA通路中同步化θ波振荡的破坏被认为会导致大鼠的情感和认知缺陷。此外，跨频率相干性在信息处理和检测场电位振荡的广泛相关性以及不同脑区之间的同步化方面具有功能意义，可能反映这些区域的功能连接性。已知相干峰值处的负滞后表明一个脑区领先于另一个脑区，反之亦然，而接近零的滞后则意味着两个脑区之间的同步活动。在本研究中，科学家们分析了rACC和BLA的LIS诱发LFP和HNS诱发LFP，发现rACC-BLA相关峰值处明显出现接近零的滞后，表明CFSS暴露后这两个脑区之间的高度同步性。此外，科学家们还发现CFSS处理大鼠的LIS诱发LFP和HNS诱发LFP在低-低、高-高、低-高频率带，以及θ波-θ波、低γ波-低γ波、θ波-低γ波频率带之间的相干系数显著增加。与这些发现一致，已有大量证据表明，有害激光刺激可诱导事件相关的θ波和γ波活动，而在慢性炎症疼痛条件下，γ波功率的幅度与θ波振荡的相位呈正相关。基线状态的θ波振荡与持续性疼痛相关，而自发γ波活动和功能连接性与慢性疼痛的严重程度密切相关。此外，抑郁样大鼠的θ波-γ波相位锁定减弱，而θ波和γ波频率带功率的变化与后续疼痛感知相关，高活性水平的θ波振荡以及神经振荡之间的平衡和耦合也与疼痛缓解显著相关。结合这些数据和科学家们的发现，他们认为CFSS暴露可能增加了rACC与BLA区域之间的功能连接性和同步性，并参与了SIH的处理。
为了进一步确定在SIH处理过程中rACC与BLA之间的神经信息流动方向性，科学家们使用LFP的相位和功率信息分析了部分定向相干（PDC），以测试这两个脑区的潜在因果效应。科学家们发现CFSS暴露显著增加了HNS诱发LFP的rACC-BLA通路在θ波频率带的归一化PDC值，表明慢性强迫游泳应激可能增强了从rACC到BLA的神经信息流动，从而介导了CFSS诱导的疼痛敏感性增强。
总之，本研究的数据表明，慢性强迫游泳应激增加了大鼠rACC神经元的活动性，促进了rACC与BLA区域之间的功能连接性和同步性，并增强了疼痛相关神经信息从rACC到BLA的流动，这些变化可能构成了应激诱导性痛觉过敏的发病机制基础。这些发现扩展了对SIH处理背后大脑机制的理解。
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